Incubatore per colture cellulari, microcentrifuga, cappa biologica e spettrofotometro UV-VIS
Marco Girasole -
Giovanni Longo -
BioTech@ISM
Diverse strumentazioni di uso comune svolgono un utile supporto per le operazioni di preparazione dei campioni: un frigo a 4°C, un freezer a -20°C; una autoclave da banco per sterilizzazione; una bilancia analitica di precisione con taratura automatica. Inoltre sono presenti un microscopio ottico classico e uno rovesciato equipaggiati con obiettivi fino a 50x che permettono un rapido controllo delle cellule in coltura.
SPECIFICHE TECNICHE
- Incubatore BINDER CB150 con controllo della temperatura con sensitività 0.1 °C e controllo della concentrazione di gas in camera con sensitività di 0,1%
- 2 linee di gas disponibili: CO2 e N2
- Ultracentrifuga da banco con timer regolabile e velocità di rotazione fino a 13000 rpm
- Cappa biologica a flusso laminare
- Spettrofotometro Jasco V-630 UV/vis/NIR a doppio braccio con singolo monocromatore. Range di lunghezze d’onda 190 – 1100 nm.
- Possibilità di lavorare a braccio singolo ed eseguire misure dinamiche di reazioni chimiche
TECNICHE DISPONIBILI
- Spettroscopia UV/Vis
- Centrifugazione/Ultracentrifugazione
CAMPIONI
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Questa strumentazione di supporto permette di tenere in coltura campioni biologici in ambiente sterile, trattarli in totale sicurezza per l’operatore. Inoltre permette la preparazione di soluzioni di interesse con la possibilità di caratterizzarle rapidamente con lo spettrofotometro.
UTILIZZATO PER
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Misure di assorbimento, trasmittanza, riflettività di campioni in soluzione nel range UV-Vis
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Misure di concentrazione di campioni in soluzione
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Misure di attività enzimatica
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Misure di progresso di reazioni chimiche
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Purificazione di campioni in soluzione mediante separazione di componenti a diverso peso molecolare (proteine, cellule, nanoparticelle etc.).
ESEMPI APPLICATIVI
Effetto tossico di DMSO su globuli rossi
Il Dimetilsulfossido (DMSO) è ben noto in letteratura come ottimo veicolante di sostanze attraverso le membrane cellulari ma, ad elevate concentrazioni, questa sostanza si intercala in modo massivo nella membrana plasmatica e può creare buchi nella stessa. Questa problematica è particolarmente importante nel caso dei globuli rossi umani a causa della loro carenza di pattern di sintesi di enzimi in grado di rimuovere l’eccesso di DMSO. Per questo motivo abbiamo seguito il processo di invecchiamento di eritrociti umani in presenza di diverse concentrazioni di DMSO per valutare la migliore condizione di lavoro possibile per somministrare sostanze alle cellule. La valutazione è stata fatta misurando la percentuale di lisi cellulare misurando lo spettro 350-700nm del supernantante di una aliquota di campioni a diversi giorni di invecchiamento.
Misura di attività di Acetilcolinesterasi (AChE) durante l’invecchiamento di globuli rossi umani
Sfruttando la possibilità di effettuare misure di cinetica enzimatica lavorando a lunghezza d’onda fissa, abbiamo valutato l’effetto del percorso di invecchiamento eritrocitario sulla attività dell’acetilcolinesterasi (AChE). In letteratura è ancora dibattuto il ruolo svolto da questo enzima nel globulo rosso ed alcuni autori suggeriscono che possa considerarsi come un marker di senescenza.
Dalle accurate caratterizzazioni eseguite seguendo un protocollo di invecchiamento accelerato in condizione di assenza di nutrienti, tuttavia, non risulta una marcata dipendenza dell’attività dell’enzima al crescere del tempo di invecchiamento cellulare. D’altro canto risulta evidente una diminuzione repentina di attività dell’enzima in seguito ad un processo di “ringiovanimento” cellulare durante il quale vengono forniti alle cellule i componenti necessari a permettergli di sintetizzare ATP e potere riducente. Questo comportamento dell’enzima è del tutto nuovo e chiama in causa regolazioni metaboliche e meccanismi molecolari che sono ancora oggetto di studio.
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