RiNaTO


Novel nanostructured coating for dental implants and prostheses with high osseointegration efficiency (RiNaTO)

 

L’obiettivo del progetto è quello di realizzare un nuovo trattamento, basato su una ricopertura con film sottili contententi carburo di titanio, per impianti chirurgici dentali ed ortopedici di titanio, al fine di migliorare fortemente il processo di osseointegrazione. Questo progetto nasce da precedenti risultati sull’effetto, su substrati di titanio, del rivestimento con un innovativo film sottile contenente una miscela controllata di carburo di titanio (TiC) e ossidi di titanio che, al momento, può essere considerato tra i migliori trattamenti per l’implantologia [Biomaterials, 28 (2007) 595-608; Surface and Coatings Technology, 204 (2010) 2605-2612]. Questa ricopertura costituisce uno strato resistente al logoramento e protettivo che, inoltre, stimola la proliferazione ed il differenziamento degli osteoblasti umani, garantendo all’impianto una alta efficienza di crescita cellulare e riducendo significativamente il tempo necessario per la definitiva osseointegrazione. La traduzione di questa nuova procedura nella pratica clinica produrrà una notevole riduzione del disagio per i pazienti ed un grosso risparmio finanziario rendendo non necessari interventi chirurgici successivi di riassestamento delle protesi.

Il principale obiettivo della ricerca è il miglioramento della procedura di ricopertura e l’ottimizzazione del trattamento attraverso l’impiego di un sistema Ion Plating Plasma Assisted (IPPA) con sorgente Magnetron Sputtering. Questo sistema di ricopertura garantisce la produzione di un film nanostrutturato con proprietà meccaniche, fisiche e chimiche non ottenibili con altre tecniche di deposizione. Siccome i parametri di deposizione dell’IPPA (tensione sul Magnetron, polarizzazione del portacampioni, concentrazione del carbonio nella camera di deposizione, ecc.) possono variare drasticamente le proprietà dello strato di ricopertura risultante, la prima fase del presente progetto si è concentrata sull’ottimizzazione step-by-step della procedura di preparazione, con la produzione di diversi substrati test per ciascuna combinazione dei parametri stessi.

Durante il progetto abbiamo confermato le proprietà biologiche della ricopertura con analisi molto specifiche atte a caratterizzare in modo approfondito la struttura e la composizione chimica dello strato ottenuto e la dinamica dell’adesione degli osteoblasti alla superficie del campione ricoperto dallo strato arricchito di carburo di titanio (TiC) [Materials Science and Engineering C, 46 (2015) 409-416] e a confermare in vivo gli effetti biologici dimostrati nelle sperimentazioni in vitro sulle cellule osteoblastiche [PLoS ONE, 11(3) (2016) e0152566].

Nell’ultima parte del progetto abbiamo confermato i risultati ottenuti con le analisi in vitro, effettuando degli esperimenti in vivo. Tali risultati sono incoraggianti e indicano che la migliore risposta del TiC si conferma anche quando analizzata in sistemi biologici complessi. Un resoconto dei risultati ottenuti verrà inserito a breve, in corrispondenza con la pubblicazione dei risultati [In preparation]


Risultati della ricerca

XPS

Tecniche di spettroscopia XPS sono state usate per determinare l’abbondanza relativa di carburo e degli ossidi di titanio e per confrontare le proprietà chimiche dei dischetti preparati utilizzando differenti parametri di ricopertura.

Il risultato di queste analisi è stato che i dischetti a 900 W hanno ancora una volta le migliori caratteristiche, con un contenuto massimo di carburo di titanio. L’analisi ha permesso di determinare anche che il carbonio presente nel film nanostrutturato è in forma grafitica. Questi risultati appaiono molto interessanti e potrebbero giustificare l’ottima risposta biologica esibita dai substrati ricoperti dal film nanostrutturato.

xps1

Test in vitro: espressione genica

Per determinare l’espressione genica delle cellule, abbiamo utilizzato la Q-RT-PCR (usando i primers ottenuti usando il Primer Express Software della Applied Biosystems, USA). L’analisi è stata condotta usando l’ABI Prism 7300 della Applied Biosystems.

Sui dischi di titanio ricoperti dallo strato nanostrutturato sono stati trovati modulati i seguenti geni:

Osteocalcin (OC)

Collagen type1A2 (COLL1A2)

Paxillin (Pax)

Four and a Half LIM domains protein 1 (FHL-1)

Integrin A3 (ITGA-3)

Runt-related transcription factor 2 (Runx-2)

con modulazione in funzione del tempo.

gene expression

A tempi brevi (2,5 ore) solo il gene dell’integrina A3 risulta modulato, tutti gli altri geni risultano modulati a 6 ore e si spengono a 15 ore. L’integrina A3 è una proteina di superficie che rappresenta il ponte che la cellula deve stabilire con l’ambiente esterno, nei nostri esperimenti il gene codificante per questa proteina risulta maggiormente espresso nella finestra temporale delle 2,5 ore. Nella finestra temporale delle 6 ore sono invece molto espressi i geni codificanti per altre proteine quali la paxillina, molecola che fa parte di quelle proteine che compongono il complesso di adesione noto come Focal Adhesion Kinase (FAK), il collagene 1A2, Runx-2, gene che esprime una proteina necessaria per il differenziamento degli osteoblasti e la morfogenesi dell’osso, FHL-1, gene di una proteina che regola e coordina i maggiori processi cellulari, OC, gene di una proteina presente solo nell’osso ed espressa dagli osteoblasti per il processo di mineralizzazione. I livelli di espressione di questi geni confrontati con l’espressione degli stessi geni in osteoblasti cresciuti su dischi di titanio, ci informa che un dialogo più efficiente tra l’osteoblasto e l’ambiente esterno si stabilisce quando l’osteoblasto cresce sullo strato nanostrutturato deposto con IPPA.

Test in vitro: immunofluorescenza

Abbiamo eseguito misure di immunofluorescenza, marcando la paxillina e l’integrina o l’actina del citoscheletro con un anticorpo specifico a cui è legata una sonda fluorescente. Per poter usufruire di tale metodica abbiamo utilizzato vetrini ricoperti con titanio e vetrini ricoperti con lo strato nanostrutturato di TiC, ambedue di spessore 10,5 nm, in modo da consentire il passaggio del 25% della luce. Gli anticorpi specifici si legavano alla paxillina e all’integrina A3 (puntini rossi) in modo molto più vistoso quando gli osteoblasti crescevano sul vetrino ricoperto dal TiC rispetto a quelli che crescevano sul vetrino ricoperto dal titanio. Anche la quantità di actina che costituisce la maggior parte del citoscheletro, (filamenti fluorescenti verdi), risulta maggiore negli osteoblasti cresciuti sul vetrino ricoperto dal TiC rispetto a quelli cresciuti sul vetrino ricoperto da titanio. Questo dialogo molecolare tra cellula e ambiente si traduce successivamente in una variazione morfologica (aumento dei filopodi e dei lamellipodi, strutture prodotte dalla cellula per aderire al substrato) come confermato dalle immagini ottenute con altre tecniche di microscopia. Anche in questo caso filopodi e lamellipodi sono prodotti in numero maggiore nelle cellule cresciute per 6 ore su dischi di titanio ricoperti dallo strato nanostrutturato rispetto e quelli prodotti dalle cellule cresciute sui dischi di titanio non ricoperti.

fluo

AFM correlativa e SEM

Successivamente alla caratterizzazione dei substrati, sono state svolte delle indagini AFM su osteoblasti cresciuti su supporti di controllo. Le immagini sono state raccolte sia su cellule fissate che su cellule vive. In entrambi i casi, per ridurre il rischio di danneggiamento del campione e contaminazione della punta causati da interazioni laterali punta-campione, si è preferito lavorare in una modalità di acquisizione denominata Quantitative Imaging (QI), tipical del microscopio Nanowizard III della JPK. Il risultato è una matrice di curve di forza che ricostruisce la morfologia del campione sotto esame ma anche le sue proprietà meccaniche. In questa maniera abbiamo potuto analizzare le cellule cresciute sui differenti substrati e confrontare tali immagini con quelle ottenute tramite SEM o tramite microscopia ottica convenzionale o in fluorescenza.

Le immagini AFM mostrano che, sui substrati trattati, le cellule hanno più filopodi e appaiono meglio adese al substrato. Tali risultati confermano con una tecnica differente i test biologici in vitro.

Il microscopio AFM utilizzato è accoppiato ad un microscopio ottico convenzionale e questo permette di accoppiare misure di microscopia convenzionale e di fluorescenza con immagini di microscopia AFM. Tali misure di correlativa permettono di identificare con tecniche diverse e complementari le diverse aree cellulari e le loro specifiche proprietà. Nello specifico, a immagini in fluorescenza sono state sovrapposte immagini AFM sia topografiche che immagini raffiguranti le proprietà meccaniche locali. Queste ultime hanno permesso di evidenziare la presenza di numerosi filamenti indicanti l’ottima adesione delle cellule sui substrati.

sem correlative

Single Cell Force Spectroscopy

Per studiare il processo di adesione degli osteoblasti alla superficie ricoperta dallo strato nanostrutturato abbiamo utilizzato una recentissima metodica di applicazione dell’AFM, la spettroscopia di forza su cellula singola (SCFS, Single Cell Force Spectroscopy) che consiste nell’usare una cellula singola pescata con la punta della micro leva dell’AFM da una sospensione di cellule, che viene quindi fatta interagire con la superficie del campione per un tempo fissato (5,10,20 sec) applicando una piccola forza costante (6 nN). La punta della micro leva viene quindi retratta misurando la forza necessaria applicata in mN per ottenere il distacco della punta dalla superficie del campione. In tal modo si determina quantitativamente l’interazione avvenuta tra le strutture molecolari della cellula e la struttura chimica della superficie alla quale la cellula aderisce. Tali esperimenti sono stati effettuati (Figura 6c) su una superficie di vetro (glass), sulla superficie di titanio non ricoperto (Ti) e di titanio ricoperto dalla nanostruttura (TiC). L’area riportata nel grafico, ricavata dalle misure della forza di adesione, indica l’adesione totale. In accordo con i risultati delle altre tecniche, tale forza risulta più grande nel caso del saggio sulla superficie di titanio non ricoperto (Ti) rispetto all’area del saggio sulla superficie di vetro (glass), ma ancora più grande nel caso del saggio sulla superficie di titanio ricoperto dalla nano struttura (TiC).

scfs

Tutte queste caratteristiche chimico-fisiche unitamente alla maggiore adesione degli osteoblasti alle superfici ricoperte dallo strato nanostrutturato sono predittive di una osseointegrazione più rapida ed efficiente degli impianti di titanio ricoperti dalla nanostruttura arricchita in TiC rispetto agli impianti di titanio non ricoperti.

Estensione alla parte industriale

Abbiamo messo a punto un dispositivo per realizzare la deposizione in maniera automatizzata su diversi impianti dentali in modo che la ricopertura fosse effettuata nelle identiche condizioni di deposizione. Un motore conferisce una rotazione di 70 giri al minuto ai perni che portano gli impianti. In questo modo la copertura degli impianti è identica a quella realizzata sui dischi di titanio appoggiati al balcone. Il risultato è un sistema che permette di ricoprire automaticamente ed in 3 dimensioni qualunque tipo di impianto o protesi in titanio, aprendo la via alla applicazione industriale della ricopertura.

Industrial